تاثیر ترکیبات فرّار (اسانس) بر کنه واروا روشی ملایم برای مبارزه با کنه ی انگلی در زنبورهای آپیس ملیفرا

تاثیر ترکیبات فرّار (اسانس) بر کنه واروا
روشی ملایم برای مبارزه با کنه ی انگلی در زنبورهای آپیس ملیفرا

ترکیبات فرار (اسانس هایی) (EO) که از گیاهان معطر گندواش (Artemisia annua)، افسنطین چینی (Artemisia verlotiorum)، درخت دارچین (Cinnamomum verum) و درخت نارنگی (Citrus reticulata) استخراج شده، به عنوان مواد دافع کنه انگلی واروآ در زنبورهای عسل، مورد بررسی قرار گرفتند. در تست‌های آزمایشگاهی، تمامی این ترکیبات (EO) به جز اسانس درخت نارنگی (C. reticulata) پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض کنه، دافعه‌ی قابل توجهی در برابر آن داشت. اسانس دارچین (C. verum) به عنوان موثرترین ترکیب در برابر کنه واروا (میانگین غلظت موثر EC50 1.30 = میکرولیتر L-1) و دارا بودن کمترین میزان سم برای زنبورهای عسل (=EC50 13.29 میکرولیتر L-1) شناخته شده است.
به دلیل میزان بالای انتخاب اسانس دارچین (C. verum)، (LD50 آپیس ملیفرا/ EC50 کنه‌ی واوآ = 10.22)، از آن برای کنترل بیماری واروازیس در کلنی‌ها در آزمایشات میدانی استفاده شد. نتایج آزمایشات انجام شده در محیط باز، اثر مشاهده شده در آزمایشگاه را تأیید کرد. پس از گذشت یک هفته از شروع درمان در کلنی‌های تحت درمان با اسانس ها، کاهش قابل توجهی از آلودگی کنه واروا (حدود 65 درصد در دوز 25.0 میکرولیتر L-1) رخ داده و هیچ اثر منفی در کلنی‌های آپیس ملیفرا مشاهده نشد. به طور کلی، با توجه به آزمایشات صورت گرفته، می‌توان از اسانس دارچین (C. verum) برای کنترل موثر واروازیس در کندو استفاده نمود که هیچ عارضه‌ی جانبی روی کلنی‌های زنبور عسل ندارد.

مقدمه
زنبورعسل آپیس ملیفرا از نظر اقتصادی مهمترین گرده افشان گیاهان تک کشت و محصولات زراعی در سراسر جهان است که ارزش اقتصادی آن در آمریکا میلیاردها دلار تخمین زده می‌شود. اصولاً استفاده از کلنی‌های زنبورعسل تنها راه حل برای اطمینان از گرده افشانی مناسب محصولات کشاورزان است. با این حال، مدیریت این کلنی‌ها به دلیل گسترش آفات زنبورعسل و استفاده نادرست و گسترده از سموم دفع آفات و علف کش‌ها به طور فزاینده ای با مشکل روبرو می‌شود.
واروازیس که توسط کنه واروا یک انگل خارجی اجباری، ایجاد می‌شود، تهدید عمده ای برای زنبورداران است. این کنه از توده بدنی زنبورهای نابالغ و بالغ تغذیه می‌کند. کنه واروآ، باعث کاهش وزن زنبورهای جوان درحال تولد در حال ظهور شده، بر ترکیب شیمیایی کوتیکول تأثیر گذاشته و سیستم پاسخ ایمنی را سرکوب می‌کند. این کنه همچنین ناقل چندین ویروس ناتوان کننده از جمله ویروس بال تغییر شکل یافته، ویروس کشمیری زنبورعسل و ویروس فلج حاد اسرائیلی است. طول عمر زنبورهای عسل بر اثر وجود کنه واروا کاهش می‌یابد که این امر باعث انحطاط، اختلال و در نهایت از بین رفتن کلنی‌ها می‌شود.
در زنبورداری تجاری، کنترل کنه واروا بوسیله‌ی درمان‌های مکرر با کنه کش‌های مصنوعی همچون ارگانوفسفات ها، پیرتروئیدها و فرمامیدین‌ها انجام می‌شود. اگرچه کاربرد این مواد شیمیایی آسان و از نظر اقتصادی مناسب است، اما رشد سویه‌های مقاوم در برابر کنه را تحریک. علاوه بر این عواملِ مصنوعی در محیط پایدار بوده و به دلیل دارا بودن ماهیت لیپوفیل، اغلب در محصولات کندو جمع می‌شوند. مواد طبیعیِ سازگار با محیط زیست، همچون اسیدهای آلی (اسید فرمیک، اسید اگزالیک و مونوترپن فنول) نیز در دسترس است. با این حال، برای تاثیر این مواد، به دوزهای بالا احتیاج است و حتی ممکن است تشکیل گله در کلنی‌ها و آلودگی محصولات کندو را به دنبال داشته باشد.
در میان مواد طبیعی، اسانس‌های (EOs) گیاهان معطر یکی از امیدوار کننده ترین گزینه‌ها برای مواد شیمیاییِ مصنوعی است که به عنوان عاملی برای کنترل آفات استفاده می‌شود و عوارض جانبی آن بسیار ناچیز است. با توجه به تمامی این دلایل، تعداد زیادی اسانس که در برابر کنه واروا اثرات مختلفی را نشان داده اند، مورد آزمایش قرار گرفته است. با این حال تعداد اسانس‌هایی که در حالت میدانی ( تحت شرایط مزرعه) در کندو تحت آزمایش قرار گرفتند، اندک بوده است.
هدف از این کار، ارزیابی اثر اسانس در کنترل واروازیس در کندو بود. به همین منظور اسانس دارچین (C. verum) به دلیل توانایی در القای جدا سازی کنه‌های واروآ از میزبان و میزان سم آن در زنبورهای آپیس ملیفرا در مقایسه با اسانس‌های گندواش (Artemisia annua L.)، افسنطین چینی (A. verlotiorum Lamotte (Asteraceae) و پوست نارنگی (Citrus reticulata Blanco (Rutaceae)، ابتدا در آزمایشگاه مورد بررسی قرار گرفته و سپس در شرایط میدانی در کندوها آزمایش شد.

وسایل و روش ها
تجزیه و تحلیل شیمیایی اسانس ها
در تابستان 2015، اسانس‌های گندواش (A. annua) و افسنطین چینی (A. verlotiorum)، از قسمت‌های گل دهنده در بالای گیاهان که از امتداد رودخانه‌ی آرنو در نزدیکی پیزا (ایتالیا) جمع آوری و استخراج شد. اسانس درخت نارنگی (C. reticulata) از غلاف میوه‌های خریداری شده از بازار محلی در پیزا (ایتالیا) بدست آمده و اسانس دارچین (C. verum) که از پوست درخت استخراج شده نیز از Sigma Aldrich (واقع در میلان، ایتالیا) تهیه شد. این اسانس‌ها آنچنان که توصیف شده، توسط دستگاه طیف سنج جرمی الکترو اسپری (GC-EIMS) مورد تجزیه و تحلیل شیمیایی قرار گرفته است. تجزیه و تحلیل با دستگاه کروماتوگراف گازی Varian CP-3800، مجهز به ستون موئین HP-5 (30 m x 0.25 mm، ضخامت پوشش 0.25 میکرومتر) و آشکارساز جرمی تله‌ی یونیِ Varian Saturn 2000 انجام شده است.
شرایط تحلیلی عبارتند از: دمای انژکتور و خط انتقال به ترتیب 220 و 240 درجه سانتیگراد، دمای فر از 60 تا 240 درجه سانتیگراد در 3 درجه سانتی گراد در دقیقه، گاز حامل هلیوم در 1 میلی لیتر در دقیقه، تزریق 0.2 میکرولیتر (10 درصد محلول هگزان) و نسبت تقسیم 1:30. تمامی تزریقات سه بار تکرار شده است. از هر اسانس، سه نمونه‌ی مستقل تهیه و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. شناسایی ترکیبات اسانس‌ها با مقایسه‌ی زمان ماندگاری با سری اِن- هیدروکربن‌ها و مطابقت رایانه با مجموعه‌ای از طیف‌های جرمی تجاری (NIST 2014 و ADAMS) و همچنین مجموعه‌ی خانگی (ساخته شده از مواد و اجزای خالص از روغن‌های شناخته شده و داده‌های طیف جرمی موجود در تحقیقات قبلی) امکانپذیر شده است (آدامز (Adams)، 2007).

حشرات و کنه ها
در اواخر بهار 2016، کنه‌های واروآی ویرانگر و شفیره‌های زنبورهای نر و کارگران بالغ گونه‌ی آپیس ملیفرا (A. mellifera)، در کندوهای مزرعه‌ی زنبورداریِ La Mieleria Del Castello Snc (واقع در نوژانو، لوکا ایتالیا) جمع آوری شد. شفیره‌های زنبورهای نر از نوزادان موجود در سلول‌های بسته بدست آمد. زنبورهای عسل کارگر بزرگسال نیز از قاب‌های کندو بوسیله‌ی یک برس در ظرف‌های شیشه ای 750 میلی لیتری جمع آوری شد. زنبورهای بزرگسال و قاب‌های دارای سلول‌های پوشیده‌ی حاوی نوزادان نر، بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شدند.

سنجش زیستی در آزمایشگاه
اثر دافعه‌ی اسانس‌ها در برابر کنه‌های واروآ، در کنار میزان سمیت آنها برای زنبورهای بالغ، بررسی شد. اثر دافعه‌ی اسانس‌ها براساس تعداد نسبی کنه‌های جدا شده از زنبورهای نرِ دارای انگل، مورد بررسی قرار گرفت. میزان سمیت برای زنبورهای بالغ براساس مرگ و میر زنبورهای کارگر ارزیابی شد. شفیره زنبورهای نرِ انگلی به شیوه‌ی توضیح داده شده توسط دیتیمان و همکاران ( Dietemann et al.، 2013)، جمع آوری شدند. به محض ورود به آزمایشگاهِ قاب ها، نوزادان سلول‌های زنبورهای نرِ باز با پنس نرم برداشته شده و شفیره‌های نر از لحاظ وجود کنه به دقت بررسی شد. شفیره‌های دارای کنه در ظرفی دارای منبع رطوبتی قرار داده شدند و در روش سنجش زیستی مورد استفاده قرار گرفت. سه شفیره‌ی نر که کنه‌های واروآ را با خود به همراه داشتند، روی کاغذ صافی گِرد خیس شده با آب گذاشته شده و در قسمت زیرین یک شیشه‌ی (750 میلی لیتر) در درب یک ظرف بتری 4 سانتی متری قرار گرفتند. ده زنبورعسل کارگر فاقد انگل نیز در همان شیشه قرار داده و به منظور اطمینان از تغذیه‌ی زنبورها در طول آزمایش، محلول آب و عسل (20 درصدی) در لوله‌ی Eppendorf® به همراه یک شاخه در اختیار آنها قرار گرفت.
یک کاغذ صافی مربع شکل ( 2 x 2 سانتی متر) با 50 میکرولیتر محلول‌های اتانولی گندواش (A. annua)، افسنطین چینی (A. verlotiorum)، درخت نارنگی (C. reticulata) یا درخت دارچین (C. verum) با غلظت‌های 0 تا 10 درصد پوشش داده شد. پس از تبخیر اتانول، به منظور دستیابی به غلظت نهایی اسانس‌ها در محیط 0.00 (کنترل/شاهد)، 0.33، 0.66، 1.33، 3.33، 4.66، ای 6.66 میکرولیتر اسانس L-1، کاغذ صافی مرطوب در قسمت داخلی درب شیشه متصل شد. یک گاز توسط یک نوار لاستیکی در دهانه‌ی شیشه زیر درب، ثابت شد. این گاز برای جلوگیری از تماس مستقیم زنبورها با اسانس‌ها در نظر گرفته شده بود. بعد از 24 ساعت، شفیره‌های نر، مورد بررسی قرار گرفته و به آرامی با یک میله به آنها ضربه ای وارد شد. شفیره ای که واکنش نشان داده بود به عنوان شفیره‌ی زنده در نظر گرفته شد. جدا شدن کنه از میزبان تنها درصورتی که شفیره‌ی نر تا انتهای آزمایش زنده مانده بود، پذیرفته شده است. تعداد زنبورهای بزرگسال مرده نیز به ثبت رسیده است. از آنجا که هیچ گونه مرگ و میری در درمانِ شاهد ثبت نشده، نرخ درصد مرگ و میر زنبورعسل اصلاح نشده است. امکان انتقال انگل بین شفیره‌ها و کارگران با بررسی تعداد کنه‌ها در ابتدا و انتهای آزمایش مورد بررسی قرار گرفت. در ابتدا و انتهای آزمایش هیچ کنه‌ی بر روی بدن کارگران مشاهده نشد. هر آزمایش سه مرتبه تکرار شد.

سنجش زیستی میدانی
اسانس درخت دارچین (C. verum) که درسنجش‌های آزمایشگاهی موثرترین اسانس در برابر کنه‌های واروآ بوده است، برای سنجش‌های میدانی انتخاب شد. سنجش زیستی در ژوئیه 2016 در مزرعه‌ی زنبورداریِ La Mieleria Del Castello Snc (نوزانو، لوکا، ایتالیا) انجام شد. میانگین دمای روزانه از 17 تا 29 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی (RH) در حدود 70 درصد بوده است. از بین کلنی‌های فعال، هجده کندو به طور تصادفی انتخاب شد. تمامی کلنی‌های انتخاب شده، مقدار مشابهی از نوزادان موجود در سلول‌های بسته را دارا بودند که از یک قاب فراتر نرفته است (حدود 9000 سلول). اسانس‌ها توسط چوب‌های چند تخته (4 x 20 سانتی متر) که قبلاً در آزمایشگاه تهیه شده بود، در کندوها قرار داده شد. میله‌ها به 2 میلی لیتر محلول اتانول حاوی 0 (شاهد)، 37.0، 150.0، 250.0، 500.0 و 1000.0 میکرولیتر اسانس درخت دارچین (C. verum) آغشته شد. سپس اتانول بوسیله‌ی نوعی دودکش بخار به طور کامل تبخیر شده، چوب‌ها در فویل آلومینیوم بسته بندی شده و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی گراد ذخیره شد. در هر کندو، دو چوب (آغشته به اسانس) قرار داده شد (40 x 40 x 50 = 80.000 سانتی متر مکعب). به منظور دستیابی به غلظت نهایی اسانس در کندوهای 0 (شاهد)، 3.1، 6.3، 12.5 و 25 میکرولیتر L-1 هوا، این چوب‌ها بوسیله‌ی یک خلال دندان بین قاب‌ها به صورت معلق در آمد. کنه‌های واروآ در سینی‌های دارای کاغذ آغشته به روغن که در قسمت تحتانی کندو قرار داده شده بود، جمع آوری شد. میزان سمیت اسانس درخت دارچین (C. verum) برای زنبورهای کارگر توسط تله‌های زیر سبدی جاسازی شده در هر کندو، ارزیابی شد.
به دلیل نوسانات اسانس ها، درمان پس از هفت روز متوقف شد. بعد از هفت روز، سینی‌ها و زیرسبدها با نمونه‌های جدید جایگزین شده و کنه‌های افتاده و زنبورهای مرده شمارش شدند. هر درمان سه بار تکرار شد. در پایان آزمایش به منظور از بین بردن و شمارش کنه‌های زنده مانده، با توجه به راهنمایی‌های گروه فعال اروپایی (European Working Group CA3686، 2001) برای هماهنگی تحقیقات در زمینه‌ی کنترل واروآ، آخرین درمان (درمان تکمیلی) با دو برابر دوز اسید اگزالیک (Apibioxal®، Chemicals Laif، SpA، Vigonza، PD، ایتالیا) در هر کندو اعمال شد. با توجه به احتمال وجود مکانیسم‌های مقاومت در کنه نسبت به قارچ کش‌های مصنوعی و به منظور کاهش ریسک میزان تاثیر بیش از حد درمان با اسانس، دوز دو برابر اسید اگزالیک ترجیح داده شده است. کلنی‌های درمان نشده در گروه شاهد (کنترل) که به منظور تحقیق بر روی مرگ طبیعی کنه‌ها و سقوط آنها به دلیل مکانیسم‌های دفاعی طبیعی میزبان (به عنوان مثال: رفتار نظافت گري، فعالیت بهداشتیِ حساس به واروآ، و غیره) مورد بررسی قرار گرفته بودند، درمان تکمیلی یکسانی را دریافت کرده اند. کارآیی درمان‌های اسانس، طبق راهنمایی‌های کارگروه اروپا CA3686 (2001)، با فرمول زیر محاسبه شد:
Dدرصد = 100 * (A – (A * B / 100)) / (A + C)
در حالی که:
Dدرصد = درصد نسبی کنه‌های واروآ که از بین رفته است.
A = تعداد کنه‌های واروآ که پس از درمان با اسانس درخت دارچین (C. verum) در سینی یافت می‌شود.
B = درصد کنه‌های واروآکه در درمان‌های گروه کنترل افتاده است.
C = تعداد کنه‌های واروآ که پس از درمان تکمیلی از بین رفته است.

تجزیه و تحلیل آماری
اطلاعات مربوط به فعالیت اسانس‌ها در برابر کنه واروا و زنبورهای بزرگسال توسط ANOVA یک طرفه و با در نظر گرفتن دوز اسانس به عنوان عامل، پردازش شد. برای تحقق فرض ANOVA، داده‌ها توسط تبدیل آرکسینوسی، نرمال شده است. ميانگين‌ها با آزمون تعقيبي توكي از هم جدا شده است. 05/0> P به عنوان سطح معنی دار تفاوت بین میانگین‌ها مورد استفاده قرار گرفت. میانه‌ی غلظت‌های موثر (EC50) برای جدا شدن کنه‌ها و مرگ و میر زنبورها، توسط رگرسیون لوگ-پروبیت (Log-probit) برآورد شده است. مقادیر EC50، به صورت جفت بوسیله‌ی تجزیه و تحلیل قدرت نسبی میانه (RMP) مقایسه شده است. نسبت انتخاب براساس گفته‌ی روفیننگو و همکاران (Ruffinengo et al.، 2005) به صورت آپیس ملیفرا LD50/ کنه واروآ EC50 محاسبه شده است. مقادیر، تنها زمانی به عنوان شاخص‌های قابل توجهی برای انتخاب در نظر گرفته شد که 95 درصد از بازه‌های اطمینان از مقادیر EC50، با هم همخوانی نداشته باشد. تفاوت بین دوزهای اسانس در مرگ و میر زنبورهای عسل در آزمایش‌های میدانی با روش Kruskal-Wallis مورد آزمایش قرار گرفت. تجزیه و تحلیل با استفاده از نرم افزار SPSS 22.0 (SPSS Inc.، شیکاگو، ایلینوی، ایالات متحده آمریکا) انجام شده است.

نتایج
تجزیه و تحلیل شیمیایی اسانس ها
تجزیه و تحلیل شیمیاییِ اسانس‌های استخراج شده از پوسته‌ی درخت دارچین (C. verum)، اجازه‌ی شناسایی 46 ماده تشکیل دهنده را فراهم کرده که مربوط به 99.4 درصد کل ترکیب اسانس است. ماده‌ی اصلی تشکیل دهنده، “ای سینامالدهید” ((E)-cinnamaldehyde) بود (جدول 1). طبقه‌ی شیمیایی اصلی توسط فنیل پروپانوئیدها (71 درصد) نمایش داده شد. تجزیه و تحلیل افسنطین چینی (A. verlotiorum)، منجر به شناسایی 39 جزء شد که 93.4 درصد از کل ترکیبات اسانس را تشکیل می‌دهد. طبقه‌ی شیمیایی غالب، مونوترپن‌های اکسیژنه بود که 48.6 درصد از کل روغن را شامل شده است. ترکیب اصلی اسانس افسنطین چینی (A. verlotiorum)، کریسانتنون مونوترپن اکسیژنه و به دنبال آن بتا- کاریوفیلن هیدروکربن سزکوئی ترپن دو حلقه ای (bicyclic sesquiterpene hydrocarbon β- caryophyllene) است (جدول 1). مونوترپن‌های اکسیژنه (48.6 درصد) بیشترین طبقه‌ی شیمیایی در این اسانس بوده است. در مورد اسانس درخت نارنگی (C. reticulata)، 18 ماده‌ی فراّر، که 99.9 درصد از کل ترکیب را تشکیل می‌دهد، شناسایی شده است. اسانس که بیشتر توسط لیمونن نشان داده می‌شود، تحت سلطه‌ی هیدروکربن‌های مونوترپن بوده است (جدول 1). اسانس گندواش (Artemisia annua) با سطح بالایی از آرتمیزیا کتون (Artemisia ketone)، 1،8- سینئول و کافور مشخص شده و به دنبال آن الکل درمنه و آلفا- پینن وجود دارد (جدول 1). مونوترپن‌های اکسیژنه در این ترکیب غالب است (75.4 درصد).

فعالیت زیستی در شرایط آزمایشگاهی در برابر کنه واروآ
نتایج سنجش زیستی در آزمایشگاه در جدول 2 گزارش شده است. هیچگونه جدائی کنه‌های واروآ در درمان گروه شاهد ثبت نشده است و تمامی اسانس‌های آزمایش شده به استثنای اسانس درخت نارنگی (C. reticulata)، فعالیت دفع واضحی را در برابر کنه واروا نشان داده اند. آزمون ANOVA اثر قابل توجهی از اسانس ( F (3, 115) = = 37.000؛ p <0.001) و دوز ( F (1,115) = 123.826؛ p < 0.001) را نشان داد. طبق مدل پروبیت، مقادیر EC50 اسانس‌ها از 30/1 تا 24/43 میکرولیتر L-1 به ترتیب برای درخت دارچین (C. verum) و درخت نارنگی (C. reticulata) متغیر بود (جدول 3). با وجود تفاوت آماری معنی داری که تنها بین اسانس‌های درخت دارچین (C. verum) و درخت نارنگی (C. reticulata) به دست آمده، تجزیه و تحلیل RMP نشان دهنده‌ی آن بود که اسانس درخت دارچین موثرترین بوده است (Log RMP = -1.265؛ CI = -0.473, -3.211).

سمیت در شرایط آزمایشگاهی علیه زنبورهای بزرگسال گونه‌ی آپیس ملیفرا
در زنبورهای بزرگسال، سمیت اسانس‌ها که در شرایط آزمایشگاهی ارزیابی شده، وابسته به دوز بوده است. پس از 24 ساعت، مرگ و میر به طور قابل توجهی تحت تأثیر اسانس (F (3, 105) = 13.130؛ p < 0.001) و غلظت (F (3, 105)= 37.000 ؛p < 0.001 ) قرار گرفت. EC50 در اسانس ها، توسط مدل پروبیت محاسبه شده و از 2.34 تا 13.29 میکرولیتر L-1 به ترتیب برای افسنطین چینی (A. verlotiorum) و درخت دارچین (C. verum) متغیر بود (جدول 3). سمیتِ نسبی که توسط تجزیه و تحلیل RMP محاسبه شده، نشان دهنده آن است که اسانس درخت دارچین (C. verum) کمترین سمیت را برای زنبورهای بزرگسال آپیس ملیفرا داشته و اختلاف آماری بین اسانس‌های درخت دارچین (C. verum) و افسنطین چینی (A. verlotiorum) ( Log RMP = 0.659؛ CI = 0.176, 2.15) و میان اسانس‌های درخت دارچین (C. verum) و گندواش (A. annua) (Log RMP = 0.539؛ CI = 0.114, 1.794) معنی دار بوده است. نسبت انتخاب برای هر درمان در جدول 3 نشان داده شده است. گندواش (A. annua) و درخت دارچین (C. verum)، موثرترین اسانس‌ها در برابر کنه واروا (به ترتیب 10.22 و SR = 1.30) بوده اند و این در حالی است که افسنطین چینی (A. verlotiorum) و درخت نارنگی (C. reticulata)، در برابر آپیس ملیفرا موثرتر بوده اند (به ترتیب 0.23 و SR = 0.75). با این حال، به دلیل همپوشانی 95 درصدی بازه‌های اطمینان، تنها نسبت انتخابِ (SR) درخت دارچین (C. verum) به طور قابل توجهی انتخاب شده است. هیچ گونه مرگ و میری در زنبورهای عسل در گروه شاهد ثبت نشده است.

سنجش زیستی میدانی
اسانس درخت دارچین (C. verum) تحت شرایط فضای باز، موجب جدا شدن کنه‌های واروآ از 16.8 تا 65.4 درصد به ترتیب در غلظت 0.075 و 2 میلی لیتر در کندو (مربوط به 0.94 و 25 میکرولیتر در L-1 هوا) شده است (جدول 4). با توجه به آزمون ANOVA، این تاثیر به دوز وابسته است ( 71.665= F (5.12) ؛ p < 0.001). میانگین دوزِ موثرِ برآورد شده (EC50)، که با مدل پروبیت محاسبه شده، 11.77 میکرولیتر L-1 (جدول 3) (مربوط به 0.94 میلی لیتر اسانس در هر کندو) بوده است. تعداد کنه‌های واروآ پس از درمان با اسانس و نیز پس از درمان تکمیلی در جدول 4 آورده شده است. در کلنی‌های زنبورعسل هیچ نوع تشکیل گله و تفاوت معنی داری در مرگ و میر زنبورعسل در میان دوزهای اسانس درخت دارچین (C. verum) مشاهده نشده است (Kruskal-Wallis، χ2 (5) = 2.268، p = 0.811). تعداد کارگران مرده‌ی ثبت شده در تله‌های زیر سبدی در طول درمان با اسانس درخت دارچین (C. verum) به ترتیب برای 3.75 و 0.94 میکرولیتر L-1 از 37.3 ± 6.2 و 52.7 ± 21.3 بوده است.

بحث
با توجه به حضور “ای سینامالدهید” ((E)-cinnamaldehyde)، بتا- کاریوفیلن (β-caryophyllene)، استات ای سینامیل ((E)- cinnamyl acetate) و اوژنول به عنوان مواد اصلی، ترکیب اسانس درخت دارچین (C. verum) با تجزیه و تحلیل‌های شیمیایی گزارش شده در منابع قبلی سازگار است. همانطور که قبلاً برای سایر گونه‌های کنه مشاهده شده بود، محتوای بالای فنول‌ها ممکن است اثربخشی این اسانس را مشخص کند. آزمایش‌های سمیت در شرایط آزمایشگاهی نشان دهنده‌ی آن است که تمامی اسانس‌ها به جز درخت نارنگی، اثر دافعه‌ی شدیدی بر واروآ داشته و باعث جدا شدن کنه‌ها از شفیره‌های زنبور نر آپیس ملیفرا می‌شود. اثر سمیت وابسته به دوز اسانس‌ها در برابر زنبورهای عسل مشاهده شده است. با این حال با توجه به داده‌های ما، اثر دافعه‌ی اسانس‌ها در برابر کنه واروا با سمیت آنها در برابر آپیس ملیفرا ارتباطی نداشته است. در شرایط آزمایشگاهی دافعه‌ی اسانس درخت دارچین در برابر کنه‌های واروآ از دیگر اسانس‌ها بیشتر بوده و کمترین میزان سمیت را برای زنبورهای عسل بزرگسال با نسبت انتخاب بالا (SR = 10.22) دارا بوده است. در راستای یافته‌های ما، فعالیت سمی انتخابی بالایی در اسانس استخراج شده از فلفل پرویی (Schinus molle L.) (تیره سماق ((Anacardiaceae) که نسبت انتخاب آن (SR > 16) است، توسط روفیننگو و همکاران (Ruffinengo et al.، 2005) ارائه شده است. کراس و برگ (Kraus and Berg، 1994) نیز افزایش قابل توجه مرگ و میر کنه‌های واروآ و نبود هر نوع اثر سمیت قابل توجهی برای زنبورها را با ترکیب 0.1 درصد اسانس دارچین به موم سلول‌های مصنوعی مشاهده کرده اند. هیچ گونه مرگ و میر زنبورهای بالغ توسط ایمدورف و همکاران نیز مشاهده نشد. پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض اسانس دارچین در 2.9 میکرولیتر L-1هوا، هیچ گونه مرگ و میری در زنبورهای بالغ توسط ایمدورف و همکاران (Imdorf et al.، 1999) مشاهده نشده است. سمیت بالاتر برای کنه واروا نسبت به آپیس ملیفرا در اسانس آویشن کوهی (Thymus kotschyanus Boiss. & Hohen) (نعناییان، Lamiaceae)، و برگ‌های درخت اکالیپتوس (Eucalyptus camaldulensis Dehn.) (تیره مورد، Myrtaceae) توسط قاسمی و همکاران مشاهده شده است. در واقع، در تحقیق حاضر، ما به سمیت قابل توجه متفاوتی در میان اسانس‌ها در برابر آپیس ملیفرا دست یافتیم. احتمالاً چنین تفاوتی به دلیل حساسیت خاص حشره به اجزای مختلف شیمیایی اسانس‌ها است. در حقیقت، براسسکو و همکاران (Brasesco et al.، 2016)، با بررسی سمیت ترکیبات خالص اسانس‌ها نشان دادند که سینامالدهید، ماده‌ی اصلی اسانس دارچین، نسبت به تیمول در برابر زنبورهای آپیس ملیفرای بزرگسال میزان سمیت کمتری را دارا است. با توجه به یافته‌های اخیر، اثرات سمی اسانس‌ها در کنه‌های واروآ نشان می‌دهد که میزان قرار گرفتن در معرض بخارات اسانس میخک (Syzygium aromaticum (L.) Merr. et Perry) (تیره مورد، Myrtaceae) بر میزان پروتئین‌های محلول در آب و فعالیت آنزیم‌های محافظ و سم زدا ( SOD، GST) تاثیر می‌گذارد (لی و همکاران (Li et al.)، 2017). در مقابل این مورد، به نظر می‌رسد اسانس‌ها و اجزای آنها به خوبی توسط زنبورهای عسل تحمل می‌شوند. اخیراً، گونس و همکاران (Gunes et al.،2017)، تأثیر درمان‌های طبیعی بر روی پروتئین‌های شوک حرارتی مغزی زنبورهای عسل(HPS 70) را بررسی کرده و به این نتیجه رسیدند که اجزای تیمول و منتول اسانس ها، غلظت HPS 70 را به همراه دارد که تفاوتی با زنبورهای گروه شاهد (کنترل) نداشته است.
اگرچه این موضوع که در آزمایشگاه تعداد زیادی از اسانس‌ها و اجزای شیمیایی آنها برای کنه واروا سمی بوده به اثبات رسیده است، اما تنها تعدادی از آنها در کندو تحت شرایط میدانی تحت آزمایش قرار گرفته است. در این تحقیق، اسانس درخت دارچین (C. verum) نیز در این زمینه موثر بوده و هیچ اثر سمی برای زنبورهای عسل (تشکیل گله یا کاهش جمعیت کلنی) مشاهده نشده است. غلظت موثر اسانس دارچین مشاهده شده در آزمایش‌های میدانی حدوداً 9 برابر بیشتر از آزمایشگاه بود (به ترتیب EC50 = 11.8 و 1.30 میکرولیتر L-1 هوا). با این حال این تفاوت با توجه به شرایط بسیار مختلفی که در آن آزمایشات انجام شده (سیستم بسته در مقابل سیستم باز، تهویه توسط زنبورهای عسل کارگر در کندو و غیره) دور از انتظار نبوده است. اثر کمتر نیز ممکن است به دلیل سلول‌های بسته‌ی نوزادان باشد که در آنصورت نفوذ آسان اسانس‌ها امکانپذیر نمی‌باشد.
به طور کلی، یافته‌های ما با آزمایش‌های قبلی در این زمینه همسو است. 1.16 و 1.50 میلی لیتر اسانس پونه‌ی کوهی را با استفاده از پنبه‌ی جاذب آغشته شده در بالای شانه‌ها آزمایش کرده اند که میزان اثربخشی آن بر مرگ و میر کنه واروآ، 57 تا 74 درصد بوده است. علاوه بر این، در مقایسه با 75 درصد مرگ و میر کنه‌ها بر اثر درمان با اسید فرمیک، پس از 24 ساعت درمان زنبورها با 2.5 میلی لیتر از اسانس‌های نعناع، آویشن، علف لیمو و رزماری، به میران مرگ و میر 57 تا 87 درصدی کنه‌ها دست یافت. اسانس‌هایی که از آویشن مرزه سی و بی (Thymus satureioides C. and B.) و مرزنجوش ای و ام (Origanum elongatum E. and M.) ( نعنائیان، Lamiaceae) از منابع گوناگون و با مراحل رشد رویشی گیاهی متفاوت استخراج شده بود را در کندوها آزمایش کرده و اثر متغیری (از 50 تا 94 درصد دوز در هر 3 میلی لیتر در هر کندو) که به ترکیب و به ویژه به محتوای نسبی موجود در برنئول و کارواکرول وابسته بود، بدست آمده است.

نتیجه گیری
واروا یکی از مهمترین آفات زنبورهای عسل است که موجب خسارات اقتصادی زیادی به زنبورداران شده و بر خدمات مهم ارائه شده توسط زنبورها به عنوان گرده افشان در اکوسیستم تأثیر می‌گذارد. اثر اسانس درخت دارچین در برابر کنه‌ی ویرانگر واروآ همراه با سمیت بسیار کمی که برای زنبورهای عسل دارا است، می‌تواند یک روش “نرم” جایگزین برای مبارزه با این انگل باشد. با این حال، ایجاد روش‌های کاربردی و فرمولاسیون بهینه‌ی اسانس جهت افزایش و گسترش کارایی، به مطالعات بیشتری نیاز دارد. امکان دارد که فرمولاسیون‌هایی که به صورت کنترل شده آزادسازی شده اند، به طور مثال با استفاده از میکروکپسولاسیون یا کپسوله سازی سل-ژل، بتوانند به منظور کاهش غلظت اولیه‌ی ماده‌ی فعال زیستی و به حداکثر رساندن مدت زمان و اثربخشی درمان از انتشار مداوم ترکیبات اسانس‌های فراّر، اطمینان حاصل کنند.

مجله زنبورداران پیشرو / سال ششم ، شماره 30 / فروردین، اردیبهشت 1400