مدت زیادی پس از مجاز شدن اولین آفت‌کش‌ها به عنوان پاسخی به گسترش کنه واروآ ویرانگر، زنبورداران در سراسر جهان پدیده مقاومت در برابر کنه‌کشی را در زنبورستان‌های خود تجربه کردند. به عبارت دیگر، درمان‌هایی که چندین سال با موفقیت استفاده می‌کردند، دیگر کارآمد نبود.
مقاومت پس از تماس مکرر کنه‌های واروآ با یک ماده فعال خاص (ماده شیمیایی) در طول زمان ایجاد می‌شود. ماده شیمیایی که کنه‌ها را می‌کشد، فشار انتخاب بالایی بر جمعیت واروآ وارد می‌کند. این بدان معناست که یافتن راهی برای کاهش حساسیت یا مقاومت در برابر یک ماده فعال به معنای واقعی کلمه یک مسئله مرگ یا زندگی برای کنه‌ها است. آن دسته از کنه‌هایی که حساسیت کمتری نسبت به ماده فعال دارند، احتمال بیشتری برای زنده ماندن از درمان و تولید مثل دارند. در نتیجه، احتمال بیشتری وجود دارد که این کنه‌ها ژن‌های خود را (از جمله آن‌هایی که مسئول ایجاد مقاومت در برابر یک ماده فعال خاص هستند) به نسل بعدی منتقل کنند.
تشخیص مقاومت جدا از سایر علل اثربخشی کم یا شکست درمان، همیشه آسان نیست. مشاهده و پایش کلنی‌های زنبور عسل در طول فصل، و تمرکز به ویژه بر توسعه سطح آلودگی به کنه در این زمینه بسیار مهم است. دانستن سطح آلودگی کنه‌ها در طول فصل می‌تواند به شناسایی “کلنی‌های فوق آلوده” در مراحل اولیه کمک کند. این مهم برای جلوگیری از انتشار تعداد بالای کنه واروآ در کل زنبورستان با درمان سریع است. مقایسه سطوح آلودگی به کنه قبل و بلافاصله بعد از درمان واروآ یک عنصر مهم برای نظارت بر موفقیت درمان در این زمینه است، اما عواملی مانند آلودگی مجدد، مهاجرت یا آلودگی قبل از درمان نیز در این ترکیب نقش دارند.
توسعه جهانی مقاومت کنه واروآ در برابر مواد فعال مختلف، زنبورداران و محققان را به سرعت به این سوال سوق داده است: چگونه زنبورداران با یک آزمایش ساده در میدانی می‌توانند تشخیص دهند که آیا جمعیت کنه‌های واروآ در کلنی‌های خاص به یک ماده فعال مقاوم هستند یا خیر. در ایالات متحده، ایده ابزاری سریع و آسان برای زنبورداران برای تشخیص مقاومت در جمعیت کنه‌ها در مزرعه اولین بار در دهه 1990 مطرح شد، زمانی که مقاومت در برابر فلووالین مشکوک شد و بعداً تأیید شد. سه تن از دامپزشکان از جمله دکتر جف پتیس از آزمایشگاه تحقیقات زنبور عسل ARS، در بلتسویل، مریلند و همکارانش پروتکلی را برای ارزیابی زیستی مزرعه ای برای زنبورداران در سال 1998 منتشر کردند.
ایده پشت این آزمایش، توسعه ابزاری بود که کاربر پسند باشد، به تجهیزات تخصصی نیاز نداشته باشد، و زنبورداران را قادر می‌سازد تا قبل از اعمال درمان‌های واروآ، مقاومت را تشخیص دهند و به آنها اجازه می‌دهد تا میزان بقای کلنی‌های خود را افزایش دهند و همچنین در هزینه‌ها صرفه‌جویی کنند. در صورتی که جمعیت کنه آنها نسبت به فلووالینات مقاوم بود، از یک درمان متفاوت (کارآمد) استفاده کنید. در مورد فلووالینیت، نتیجه سنجش کمتر از 50 درصد مرگ‌ومیر کنه نشان‌دهنده مقاومت است، زیر 25 درصد نشان‌دهنده مقاومت کامل است. هدف از رویکرد “علم دقیق”، قرار دادن کنه‌های واروآ در معرض مواد شیمیایی در آزمایشگاه، ارائه ابزاری ساده و سریع برای زنبورستان به زنبورداران بود.
اصل اساسی سنجش‌های زیستی مزرعه ای این است: زنبورداران تجهیزاتی از جمله یک شیشه یا ظرف دیگر، تکه ای از نوار شیمیایی را برای آزمایش، احتمالاً یک پیمانه، یک سطل، کاغذ سفید، محلول الکلی و ابزارهای دیگر می‌آورند. به زنبورستان آنها نمونه زنبور عسل (و در نتیجه کنه واروآ چسبیده) را از ناحیه زاد و ولد کلنی‌های خود می‌گیرند و مراقب باشند که ملکه را در نمونه قرار ندهند. سپس نمونه برای مدت زمان از پیش تعریف شده در معرض یک قطعه از نوار حشره کش مذکور قرار می‌گیرد. پس از گذشت زمان نوزادی، کنه‌های مرده روی یک سطل سفید یا تکه کاغذ شمارش می‌شوند. شستشوی الکل با نمونه زنبور عسل انجام می‌شود تا تمام کنه‌هایی که در طول زمان جوجه کشی از بین نرفتند شناسایی شود. اکنون می‌توان میزان مرگ و میر کنه‌ها را در طول زمان انکوباسیون (قرار گرفتن در معرض کنه کش) محاسبه کرد. فرض بر این است که نشان دهنده درصد کنه‌های حساس در نمونه است (در مقابل کنه‌های مقاوم = کنه‌های زنده‌مانده که در طول مدت کشته نشده‌اند.
* زیست سنجی میدانی برای تشخیص مقاومت آمیتراز
در سال‌های اخیر، مقاومت به آمیتراز در کنه‌های واروآ در برخی از مناطق فرانسه و ایالات متحده گزارش شده است. علیرغم شیوع کمتر و تکه‌ای مقاومت آمیتراز در مقایسه با، برای مثال، مقاومت به پیرتروئید در کنه‌های واروآ، چندین محقق از آن زمان تاکنون روی توسعه یک سنجش زیستی مزرعه‌ای برای زنبورداران کار کرد که به طور خاص با این مولکول مناسب است. اکثر آنها از درمان مجاز نوار آمیتراز، آپیوار، برای افشای کنه‌های موجود در نمونه زنبور عسل در معرض آمیتراز استفاده کرده اند. دوره‌های مختلف مواجهه کنه‌های واروآ نسبت به ماده فعال (از 2 ساعت تا 24 ساعت) آزمایش شده است. اندازه‌های مختلف قطعه نوار آپیوار و روش‌های مختلف برای تثبیت نوار داخل ظرف با نمونه زنبور (و کنه) بررسی شده است.
برخی از عوامل کلی که باید در پروتکل‌های سنجش زیستی در نظر گرفته شوند، شامل همه عواملی هستند که حول تاریخ انقضا و بسته‌بندی نوارهای آزمایش استفاده شده در سنجش‌ها می‌چرخد. تمام تیمارهای نواری علیه کنه‌های واروآ با ترکیبات مختلف (آمیتراز، فلومترین، کومافوس) دارای ماندگاری خاصی هستند و هر دسته / مقدار تولید شده از محصول دارای تاریخ انقضا است. البته، این تاریخ‌های انقضا نه تنها باید در هنگام استفاده از نوارها به عنوان درمان واروآ در کلنی‌های زنبور عسل رعایت شود، بلکه باید زمانی که از آنها برای تشخیص مقاومت در زنبورستان استفاده می‌شود نیز رعایت شود. حتی اگر بسته بندی اصلی نوارها باید باز شود تا بتوان به آنها دسترسی داشت و آنها را به قطعات کوچکتر برای آزمایش میدانی برش داد، باید از ارسال نوارها یا قطعات نوار در بسته بندی متفاوت از محصول اصلی خودداری شود. به محض باز شدن بسته بندی اصلی و مهر و موم شده محصول، فرآیند تخریب در اثر قرار گرفتن در معرض هوا (به طور دقیق تر، اکسیژن) و نور خورشید آغاز می‌شود.
علاوه بر آن، زمان‌بندی زیست‌سنجی میدانی باید عاقلانه در نظر گرفته شود. برای سلامت کلنی، آزمایش مقاومت قبل از فصل درمان توصیه می‌شود. بنابراین زنبورداران می‌توانند حساسیت جمعیت کنه‌های واروآ در زنبورستان‌های خود را نسبت به یک مولکول خاص قبل از انتخاب درمان واروآ تخمین بزنند، اما کارایی صحرایی دقیق درمان مجاز را پیش‌بینی نمی‌کند.
پروتکل‌های سنجش زیستی برای تشخیص مقاومت آمیتراز توسط Pettis (2019)، Higes و همکاران پیشنهاد شده‌اند. (2020)10 و دیگران. پروتکل‌های مختلف عمدتاً در سه جزئیات روش شناختی متفاوت هستند:
* ثبات یا عدم وجود دمای محیط در طول آزمایش
دوره مواجهه ای که در آن کنه‌ها در معرض ماده فعال (آمیتراز) قرار می‌گیرند. نمونه برداری از نمونه‌های کامل زنبور عسل (از جمله کنه‌های واروآ) در مقابل نمونه برداری فقط از کنه‌های واروآ (از نسل زنبور عسل و انتقال در ظروف پتری یا ویال‌های شیشه ای). ثبات یا عدم وجود دمای محیط در طول آزمایش. دوره مواجهه ای که در آن کنه‌ها در معرض ماده فعال (آمیتراز) قرار می‌گیرند.
نمونه برداری از نمونه‌های کامل زنبور عسل (از جمله کنه‌های واروآ) در مقابل نمونه برداری فقط از کنه‌های واروآ (از نسل زنبور عسل و انتقال در ظروف پتری یا ویال‌های شیشه ای).
* دما مهمه
پتیس (2019) در سنجش‌های انجام شده در دمای 70 درجه فارنهایت (21 درجه سانتیگراد) در مقایسه با سنجشهایی که در دمای 90 درجه فارنهایت (32 درجه سانتیگراد) انجام شده است، تلفات کنه کمتری پیدا کرده است. پروتکل هایگز و همکاران (2020) با قرار دادن کنه‌ها در معرض آمیتراز در دمای ثابت 34 درجه سانتیگراد (93.2 فارنهایت) به رویکرد کنترل شده تری متکی است. پروتکل پیشنهاد شده توسط Rinkevich (2020) هیچ نوع کنترل دمایی نمونه‌های زنبور عسل (و کنه) را در طول قرار گرفتن در معرض آمیتراز پیشنهاد نمی‌کند. البته، ممکن است استدلال شود که الزام به نگه داشتن نمونه‌های زنبور عسل (و کنه) در دمای ثابت، عملی بودن را در مزرعه کاهش می‌دهد.
با این حال، وزارت کشاورزی در بریتیش کلمبیا قبلاً یک پروتکل آزمایش پتیس برای آمیتراز در سال 201512 منتشر کرده است. این پروتکل چندین جایگزین را برای ارائه حداقل کنترل دمای محیط در این زمینه پیشنهاد می‌کند:
شیشه‌ها را به مدت 6 ساعت در انکوباتور یا اتاق گرم، در تاریکی قرار دهید. از طرف دیگر، شیشه‌ها را در یک ظرف پیک نیک با چند بطری آب گرم قرار دهید. بعد از 3 ساعت اول بطری‌ها را با آب داغ پر کنید. مطمئن شوید که در شیشه‌ها پوشیده نباشد تا زنبورها هوا داشته باشند. این پروتکل، مشابه هدف اصلی آزمایش‌های زیستی مزرعه‌ای پیشنهاد شده توسط پتیس، شامل سلب مسئولیت زیر است: “این سنجش برای غربال کردن کنه‌های مقاوم در نظر گرفته شده است و برای نشان دادن سطح دقیق مقاومت در نظر گرفته نشده است.”
اثرات بالقوه دما بر نتایج سنجش زیستی را نباید در آزمایش‌های آینده نادیده گرفت و باید برای پروتکل‌های مختلف ارزیابی شود. توجه به زمان قرار گرفتن در معرض دما، توصیه دکتر پتیس (2019) 3 ساعت و وزارت بریتیش کلمبیا (2015) 6 ساعت قرار گرفتن در معرض نمونه زنبور عسل را نسبت به آمیتراز پیشنهاد می‌کنند. زمان‌های قرار گرفتن در معرض دما کوتاه‌تر معمولاً از روش‌های زیست‌سنجی آزمایشگاهی 9-12 یا مخلوطی از سنجش‌های آزمایشگاهی و میدانی مانند پروتکل پیشنهاد شده توسط Higes و همکاران شناخته می‌شوند. (2020). پروتکل Rinkevich (2020) تنها پروتکل زیست سنجش میدانی است (کار با نمونه‌های زنبور عسل گرفته شده از کلنی‌های آزمایش، قرار دادن نمونه‌ها در معرض تیمارهای نواری، و کنترل نکردن دمای محیط) که دوره نوردهی کوتاه‌تری به مدت سه ساعت را توصیه می‌کند.
ارتباط دوره‌های قرار گرفتن در معرض سنجش‌های زیستی نیز در میان کارشناسان مورد بحث قرار گرفته است. در حالی که احتمال به دست آوردن نتایج منفی کاذب (= جمعیت‌های واروآ که به اشتباه به عنوان «حساس» طبقه‌بندی شده‌اند) با زمان‌های قرار گرفتن در معرض طولانی‌تر توسط برخی پیشنهاد شده است، عامل اصلی تعیین‌کننده زمان قطع دوره قرار گرفتن در میدان احتمالاً زنده بودن کنه‌های واروآ با نگاهی به دوره‌های مواجهه پیشنهادی در سنجش‌های مختلف (آزمایش‌های صحرایی و آزمایشگاهی)، زمان‌های قرار گرفتن در معرض معمولاً بین 1 تا 6 ساعت است. در سنجش‌های آزمایشگاهی، زمانی که کنه‌های واروآ ممکن است به غذا (زنبورها یا لاروها) دسترسی نداشته باشند، زنده‌مانی ممکن است نقش مهم‌تری ایفا کند و زمان مواجهه معمولاً کوتاه‌تر است. با این حال، در آزمایش‌های مزرعه‌ای که کنه‌های واروآ به میزبان خود متصل شده و از آن تغذیه می‌کنند، احتمال زنده ماندن آنها (بدون قرار گرفتن در معرض ماده فعال) پس از 3 ساعت لزوماً با بقای پس از 6 ساعت تفاوت قابل‌توجهی ندارد. اینکه آیا یک دوره قرار گرفتن در معرض 6 به جای 3 ساعت مرگ و میر کنه را به دلایلی غیر از قرار گرفتن در معرض ماده فعال به طور قابل توجهی افزایش می‌دهد یا خیر، باید ثابت شود. از آنجایی که هدف اولیه یک سنجش زیستی میدانی تعیین حساسیت یا مقاومت نسبت به مواد فعال است، از مشاهده نتایج مثبت کاذب (= جمعیت واروآ که به اشتباه به عنوان “مقاوم” طبقه بندی می‌شوند) باید با انتخاب دوره‌های مواجهه طولانی مدت اجتناب شود.9-12مواد استفاده شده توسط تیم Véto-pharma.
* نمونه برداری: نمونه کامل زنبور عسل یا فقط کنه واروآ؟
در پروتکل هایگز و همکاران. (2020)، به‌جای افشای کل نمونه زنبور، کنه‌های واروآ به‌صورت جداگانه نمونه‌برداری می‌شوند و در گروه‌های 15.10 تایی در معرض تکه‌ای از نوار آمیتراز در ظرف پتری قرار می‌گیرند. قرار گرفتن در معرض سنجشهایی مانند این بسیار کمتر به فعالیت زنبور وابسته است. قرار گرفتن کنه‌های واروآ با ماده فعال فوری‌تر است، زیرا کنه‌ها مستقیماً با یک تیمار نواری یا پتری پوشیده شده با ماده فعال تماس می‌گیرند. البته نمونه برداری از کنه‌های منفرد و قرار دادن آنها در معرض آمیتراز در دمای کنترل شده برای زنبورداران در مزرعه راحت تر است. با این حال، این امکان را برای یک روش استانداردتر در شرایط آزمایشگاهی فراهم می‌کند.
* نتیجه
به طور کلی، محققان، تکنسین‌ها و کارشناسان زنبورداری که روی توسعه زیست‌سنجی مزرعه‌ای برای استفاده گسترده در زنبورداری توصیه می‌شوند، باید از مسئولیت سنجش دقت در برابر کاربرپسندی و عملی بودن در این زمینه آگاه باشند. انتظار زنبورداران برای انجام آزمایش‌های مقاومت سریع در مزرعه، در صورت امکان، باید بدون کنار گذاشتن روش‌هایی که ممکن است پروتکل را کمی پیچیده‌تر کند، اما می‌تواند به طور قابل‌توجهی قابلیت اطمینان نتایج سنجش را در مزرعه بهبود بخشد، شناسایی شود.
این امر به ویژه برای بازرسان زنبور عسل و یا مشاوران زنبورداری و یا تکنسین‌هایی که ممکن است انجام آزمایش‌های زیستی را به عنوان ابزاری تشخیصی برای تشخیص وجود مقاومت در زنبورستان توصیه کنند بسیار مهم است. چنین ارزیابی دقیقی از نتایج بیوآسی شامل تمایز بین حساسیت کنه (حساس در مقابل مقاوم) و اثربخشی میدانی یک درمان مجاز است، زیرا یکی با دیگری برابر نیست. در واقع، طبقه‌بندی درصدهای مختلف مرگ‌ومیر کنه‌های واروآ در سنجش‌های زیستی به‌عنوان «کارآمد»، «بیشتر کارآمد» یا «مقاوم» با نیت خوبی است، اما تا حدودی خودسرانه است. تلاش‌های مستمری برای بررسی پروتکل‌های زیست‌سنجی میدانی برای تشخیص نیاز است. مقاومت آمیتراز در زنبورستان و به دست آوردن بهترین تعادل ممکن بین برآوردن نیازهای زنبورداران و رعایت استانداردهای روش شناختی مورد نیاز برای نتایج سنجش قابل اعتماد همچنین مورد نیاز است.
